尊龙凯时 婴儿利什曼虫探针法荧光定量PCR试剂盒使用手册 V11

CAT#: 15-18620 低温运输，-20℃ 保存

产品简介
本试剂盒专为检测婴儿利什曼虫（Leishmania infantum）而设计，该寄生虫能够引起动物源性内脏利什曼病（黑热病）。研究显示，婴儿利什曼虫感染人或犬后可无明显症状，然而无症状感染的犬已被证明在疾病传播中发挥了重要作用。本产品基于探针法荧光定量PCR技术，具有以下特点：

• 即开即用，使用者仅需提供DNA模板。
• 包含阳性对照，便于识别假阴性样品。
• 反应快速，灵敏度高。
• 可用于50次20μL体系的探针法荧光定量PCR，专供科研用途。

规格及成分

• 2×Probe qPCR Mix: 600μL (编号: 190504a)
• DEPC-H₂O: 1mL (编号: 180701)
• 婴儿利什曼虫qPCR引物-探针混合液: 90μL (编号: 15-18620yp)
• 阳性对照: 50μL (1×10⁸拷贝/μL) (编号: 18620pc)
• 使用手册: 1份 (编号: 15-18620sc)

运输及保存
本试剂盒应低温运输，并在-20℃下保存，贮存期限为一年。阳性对照需单独存放，避免与其他试剂交叉污染。用户需自行准备样品DNA和超纯水。

使用方法
一、DNA提取
使用自选的方法提取纯化样品DNA，本试剂盒兼容市面上大部分核酸提取试剂盒。

二、稀释标准曲线样品
（阳性对照浓度较高，请在独立区域进行以下稀释操作，以避免样品或试剂盒其他成分的污染。）

1. 标记6个离心管（7、6、5、4、3、2）。
2. 在每个管中加入45μL DEPC-H₂O（建议使用带芯枪头）。
3. 在7号管中加入5μL阳性对照（1×10⁸拷贝/μL），充分混合1分钟，得1×10⁷拷贝/μL的标准曲线样品。
4. 重复相应操作稀释至所需浓度，直至得到6个标准曲线样品。如果不需要制作标准曲线，可直接将阳性对照稀释至1×10⁵拷贝/μL。

三、试剂配制
若待检测样品数为N，准备N+2个qPCR管（N个样品管 + 1个阴性对照 + 6个阳性对照），向各PCR管中分别加入以下成分：

（每管成分摘要）
2×Probe qPCR Mix: 各10μL
婴儿利什曼虫qPCR引物-探针混合液: 各15μL
DEPC-H₂O: 各65μL

四、添加模板
向qPCR管中添加2μL模板，添加顺序为阴性对照（DEPC-H₂O）、待测样品模板和阳性对照，离心30秒，立即进行扩增反应。

五、扩增反应
将PCR管放置于PCR扩增仪样品槽中并进行扩增，扩增程序如下：

• 预变性: 95℃，3分钟
• qPCR反应（40个循环）:
  • 95℃，15秒
  • 58℃，20秒
  • 72℃，20秒（采集FAM通道的荧光信号）

六、结果分析
1. 如制作标准曲线，使用阳性对照浓度的log值为横轴，Ct值为纵轴，绘制标准曲线，从标准曲线上推算样品DNA浓度的log值。
2. 如不制作标准曲线，依据以下标准判定结果：阳性对照Ct值应<30且具有明显的指数增长，阴性对照Ct值为38或无Ct值，无明显指数增长。待测样品Ct值<35且有明显指数增长为阳性；Ct值为38或无Ct值为阴性；Ct值在35-38的样品需复检，若未能确认往返阴性，则按阳性处理。

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