破骨细胞诱导分化机制解析

破骨细胞是一种独特的多核细胞，起源于造血干细胞，通过巨噬细胞的分化而成，主要负责骨吸收过程。在此背景下，RANKL/RANK/OPG信号通路成为调节破骨细胞分化的核心组成部分，能够精确控制破骨细胞与成骨细胞之间的功能平衡，从而维持骨骼的稳态。

RANKL/RANK/OPG信号通路作用机制

核因子κB受体活化因子配体（RANKL）被视为促进破骨细胞分化和功能活性的重要因子。巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）能够诱导RANK在破骨细胞前体细胞膜上的表达，使得这些前体细胞与RANKL结合，从而诱导其向破骨细胞的方向发展。然而，破骨细胞在体内的数量较少，仅占分离细胞的0.8%-1.2%，因此在体外提取和培养破骨细胞面临一定困难。目前，常用的诱导方法包括骨髓单核细胞诱导法和RAW264.7细胞系诱导法。

骨髓单核细胞诱导法步骤及注意事项

01 选用8-12周龄雄性C57BL/6J小鼠，采用CO2吸入法处理后，使用75%乙醇进行消毒。

02 在无菌条件下完整取下小鼠后肢，去除多余的皮肤与肌肉组织，并将骨头置于含有2%青霉素-链霉素的PBS中。

03 分离骨髓时，注意全程无菌操作，避免污染。

04 利用注射器向骨头注入α-MEM，冲洗出骨髓细胞，并通过70μm筛网过滤。

05 进行红细胞裂解处理后，重悬于含有M-CSF的培养基中，转移至培养皿中培养。

06 每隔一天更换培养基，待细胞贴壁至80%-90%后，再培养至诱导阶段。

07 加入RANKL诱导破骨细胞的分化，通常在第4-5天观察到明显的破骨细胞形成。

08 按照TRAP染色程序进行染色观察，具有三个或更多细胞核且呈紫红色的细胞为破骨细胞。

RAW264.7细胞系诱导法步骤与注意事项

01 RAW264.7细胞在含10%FBS的DMEM中常规培养，待细胞密度达到80%-90%后进行传代。

02 用含10%FBS的α-MEM培养基将细胞制成悬液接种到24孔板中，以2×10⁶ cells/孔的密度进行培养。

03 接种12小时后，添加RANKL诱导因子，统计表明此浓度能够实现最佳的破骨细胞诱导效果。

04 每三天更换培养基并补加RANKL，通常在4至5天后可观察到多核破骨细胞的形成。

05 通过TRAP染色对破骨细胞进行鉴定，确保实验的结果可靠。

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